ICS 67.050 53 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 21329—2007 动物源性食品中庆大霉素残留量 测定方法 酶联免疫法 Method for the determination of gentamicin residues in animal original foodEnzyme-linked immunosorbent assay 2007-10-31发布 2008-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21329—2007 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局 本标准主要起草人：施伟良、张晓峰、方莹、谢文、朱振江。 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T21329—2007 动物源性食品中庆大霉素残留量 测定方法酶联免疫法 1范围 本标准规定了肉类、内脏、水产品、牛奶和奶粉中庆大霉素残留量的酶联免疫测定方法 本标准适用于肉类、内脏、水产品、牛奶和奶粉中庆大霉素残留量的测定 本标准的方法检出下限：肉类和水产品为10.0ug/kg；内脏、牛奶和奶粉中为20.0ug/kg 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所 有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研 究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379（所有部分）测量方法与结果的准确度（正确度与精密度） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 微孔板中包被有绵羊抗兔IgG抗体，加人特异性抗体（免抗庆大霉素抗体）、酶标记庆大霉素、庆大 霉素标准品或样品后，特异性抗体与包被的绵羊抗免IgG抗体结合，同时游离庆大霉素和酶标记庆大 霉素竞争性的与特异性抗体结合。通过洗涤除去未结合的庆大霉素和酶标记庆大霉素，然后加人底物 显色，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中庆大霉素的含量。 4试剂和材料 除去另外说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1庆大霉素检测试剂盒（组成参见附录A)。 4.2 三氯乙酸。 4.3氯化钠。 4.4氯化钾。 4.5 磷酸二氢钾。 4.6磷酸氢二钠。 4.7 磷酸二氢钠。 4.8 吐温-80。 4.9 3%三氯乙酸：称取3g三氯乙酸（4.2），用水定容至100mL。 4.10 0PBS缓冲液：8.5g氯化钠，1.15g磷酸氢二钠，0.27g磷酸二氢钠，用水定容至1L。 4.11SDB缓冲液：1.15g磷酸氢二钠,0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，30g氯化钠，0.5mL吐 温-80，用水定容至1L。 4.12正已烷。 4.13庆大霉素标准品为USP级。 4.14庆大霉素标准品溶液的配制：用灭菌水作为溶剂配制成50mg/mL的储存液，于一20℃条件 下保存。 1 GB/T21329—2007 5仪器 5.1酶标仪。 5.2八道移液器：50μL~300μL 5.3单道移液器：5μL~50μL，100μL~1000μL和2mL~10mL。 5.4混合振荡器。 5.5离心机。 SAG 5.6 具塞试管：20mL，50mL。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 对组织样品：从全部样品中取有代表性样品，混匀，用四分法缩分出不小于1000g试样，去除脂 肪、充分绞碎、混均、分装、密封，并加以标识。 对牛奶和奶粉：从原始包装中取有代表性样品，充分混匀，用四分法缩分出不小于500g试样，装入 清洁密闭容器，加封后标明标记。 6.2试样的保存 将样品于-18℃～-20℃条件下保存。 7分析步骤 7.1提取 7.1.1组织 称取2.5g去脂肪均质样品，精确到0.1g，置于50mL具塞试管中，加人5mLPBS缓冲液（4.10 振荡10min，加人10mL的3%三氯乙酸（4.9）涡旋10min，6000r/min离心15min。取3mL上清液 于二干净试管，再加人2mL正已烷（4.12）混合3000r/min离心10min，吸取150μL下层液体加 350μL的SDB(4.11)缓冲液，调节pH至7.5左右。最后稀释倍数为20。 7.1.2牛奶 牛奶样品先离心去脂肪，然后以SDB缓冲液（4.11)直接做10倍稀释；对于奶粉则可以先用与样品 质量相等的水进行稀释溶解，离心去脂，然后再以SDB缓冲液（4.11）做5倍稀释，调节pH至7.5左 右，最后稀释倍数为10。 7.2测定条件 7.2.1酶标仪测定条件 酶标仪测定波长为450nm。 7.2.2洗板条件 7.2.2.1人工洗涤次数5次以上，每次注水量为250μL。 7.2.2.2自动洗板可以预定5次周期。 7.2.3操作条件 所有操作应在室温下（20℃～24℃）进行，庆大霉素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温 (20℃~24℃）后方可使用。 7.3测定步骤 7.3.1将测定需用的微孔板备齐并插人微孔架上，记录标准品及样品等在微孔架上的位置。 1）给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品操作步骤的认可。如果其他产品的操作步骤有不 同，需经实验评估后采用。 2 GB/T21329—2007 7.3.2吸取100μL零浓度标准品于孔A1、A2：并吸取50μL零浓度标准品于孔B1、B2；分别吸取 溶液于其余微孔中。 7.3.3分别吸取25μuL庆大霉素酶标记物溶液于除A1、A2外的每一个微孔。 7.3.4分别吸取25uL庆大霉素抗体溶液于除A1、A2外的每一个微孔。 7.3.5用封口膜封孔条，并持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀。 7.3.6将酶标板置于4℃避光孵育1h。 7.3.7倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液，但不能使微孔干 燥。再立即用洗涤缓冲液按7.2.2条件进行洗板，要注意不能使微孔干燥 7.3.8迅速加人100μL底物溶液于每一个微孔底部，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于 20℃~24℃避光孵育30min 7.3.9迅速加人100μL反应终止液于每一个微孔。持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微 孔架置于酶标仪中，在450nm处测量吸光度（加人反应终正液后应在30min内读取吸光度）。 注：测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。 7.4平行试验 按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定， 7.5空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行。 SAC 7.6监控试验 每次测定均应做一个添加庆大霉素标准（4.14)的样品。 8结果计算 从含有标准品和样品的板孔的吸光度（OD)值中，减去空白孔A1、A2的平均OD值。标准品和样 品的OD平均值除以零标准（B1、B2）的平均OD值，再乘以100。零标准为100%（最大吸光度值），其他 OD值为最大吸光度值的百分数 在半对数坐标纸上，以吸光度值为纵坐标（%），庆大霉素标准溶液浓度（ug/L）为横坐标，绘制标准 工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的庆大霉素浓度后，结果按式（1）进行计算： ...(1) mX1000 式中： X一一样品中庆大霉素的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）； c——从标准工作曲线上得到的样品中庆大霉素浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V一样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（mL)； m—样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克（g）。 注：所得结果应表示至一位小数。也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算， 9确证试验 如被测样品中庆大霉素残留量的值大于限量要求时，应用其他方法进行确证 回收率参见附录B。 3