UDC_628.515:543.062 中华人民共和国国家标准 GB/T154411995 水质 急性毒性的测定 发光细菌法 Water quality--Determination of the acute toxicity -Luminescent bacteria test 1995-03-25发布 1995-08-01实施 国 家环境保护局 发布 国家技术 监督局 中华人民共和国国家标准 GB/T 15441—1995 水质急性毒性的测定发光细菌法 Water quality--Determination of the acute toxicity --Luminescent bacteria test 1主题内容与适用范围 1.1主题内容 本标准规定了测定水环境急性毒性的发光细菌法。 1.2适用范围 本标准适用于工业废水、纳污水体及实验室条件下可溶性化学物质的水质急性毒性监测。 2方法提要 基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关（P≤0.05)，因而可通过生物发光 光度计测定水样的相对发光度，以此表示其急性毒性水平。 水质急性毒性水平按8所述条件选用相当的参比毒物氯化汞浓度（以mg/L为单位）来表征，或选 用ECso值（半数有效浓度一一以样品液百分浓度为单位）来表征。 3试剂和材料 3.1氯化汞HgCl2。 3.2 氯化钠 NaCl,化学纯， 3.3明亮发光杆菌T，小种（PhotobacteriumphosphoreumT，spp.）冻干粉，安瓶包装，每瓶o.5g，在 2~5℃冰箱内有效保存期为6个月。新制备的发光细菌体眠细胞（冻干粉）密度不低于每克800万个细 胞：当按6.2.4步骤将冻干粉复苏2min后即发光（可在暗室内检验，肉眼应见微光），稀释成工作液后 每毫升菌液不低于1.6万个细胞（5ml测试管）或2万个细胞（2ml测试管）(均为稀释平板法测定）。在 于1900mV允许将倍率调至“X0.5”档。仍达不到标准者，更换冻干粉。 3.4氯化钠溶液，3g/100ml。 氯化钠3g于玻璃容器内，用量简加蒸馏水100ml。 3.5氯化钠溶液，2g/100ml。 氯化钠2g，加蒸馏水100ml,于试剂瓶内,2～5℃保存。 3.6参比毒物氯化汞标准溶液。 0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,0.20,0.22,0.24 mg/1.. 3.7氯化汞母液，p2000mg/L。 万分之一分析天平精称密封保存良好的无结晶水氯化汞0.1000g入50ml容量瓶，用3g/100ml 氯化钠溶液稀释至刻度，置25℃冰箱备用，保存期6个月。 国家环境保护局1995-03-25批准 1995-08-01实施 1 GB/T15441-1995 3.8氯化汞工作液，p=2mg/L。 用移液管吸氯化汞2000mg/L母液10ml入1000ml容量瓶，用3g/100ml氯化钠溶液定容。再 用移液管吸取氯化汞20mg/L液25ml入250ml容量瓶，用3g/100ml氯化钠溶液定容，将此液倒入 配有半微量滴定管的试液瓶，然后,用 3g/100 ml氯化钠溶液将氯化汞 2 mg/L溶液按表 1稀释成系列 浓度（一律采用50ml容量瓶）。这些氯化汞稀释液保存期不超过24h，超过者务必重配。 表1氯化汞工作溶液稀释配制系列（在50ml容量瓶中） 加氯化秉(2 mg/L)数，ml 0. 5 1.0 1. 5 ,2.0 2. 5 3. 0 3.5 4. 0 4.5 5.0 5.56.0 稀释定容后氟化汞浓度，mg/L 0.020.04 0.060.080.100.120.140.16 0.18 0. 200. 220.24 4仪器 4.1生物发光光度计。 配置2或5ml测试管。 当氯化汞标准溶液浓度为0.10mg/L时，发光细菌的相对发光度为50%，其误差不超过士10%。 4.22ml或5ml测试样品管（具标准磨口塞，为制造比色管的玻璃料制作，由专业玻璃仪器厂制造）， 分别适用于相应型号的生物发光光度计。 4.3微量注射器：10ul。 4.4注射器：1ml。 4.5定量加液瓶：5ml。 4.6吸管：2、10.25ml。 4.7试剂瓶：100ml。 4.8量筒：100、500ml。 4.9棕色容量瓶：50、250.1000ml。 4.10半微量滴定管（配磨口试液瓶，全套仪器均为棕色）：10ml。 5样品 5.1样品的采集和保存 采样瓶使用带有聚四氟乙烯衬垫的玻璃瓶，务必清洁、干燥。采集水样时，瓶内应充满水样不留 a. 空气。采样后，用塑胶带将瓶口密封。 b.毒性测定应在采样后 6 h内进行。否则应在2～5℃下保存样品，但不得超过24 h。报告中应写 明水样采集时间和测定时间。 c.对于含固体悬浮物的样品须离心或过滤去除，以免干扰测定。 5.2样品液的稀释 5.2.1样品液测定前稀释的条件 5.2.1.1样品液预试验取事先加氯化钠至3g/100ml浓度的样品母液2ml装入样品管，并设一支 CK管（氯化钠3g/100ml溶液）,按6所述测定相对发光度。 5.2.1.2按5.2.1.1测得的样品，相对发光度低于50%乃至零，欲以ECso表达结果，则须稀释。 5.2.1.3按5.2.1.1测得的样品，相对发光度在1%以上，欲以与相对发光度相当的氯化汞浓度表达 结果，则不须稀释。 5.2.2样品液的稀释液 样品液的稀释液一律用蒸馏水，在定容前一律按构成氯化钠3g/100ml浓度添加氯化钠或浓溶液 （母液只能加固体）。 5.2.3样品液稀释浓度的选择 2 GB/T 15441—1995 5.2.3.1探测试验 按对数系列将样品液稀释成5个浓度：100%、10%、1%、0.1%、0.01%(它们的对数依次为01， -2,一3,一4),按 6所述粗测一遍视1%～100%相对发光度落在哪一浓度范围。 5.2.3.2试验 在 1%~100%相对发光度所落在的浓度范围内再增配 6~9 个浓度(例如,若落在 0. 1%~10%之 间,则应稀释成 0.1%、0.25%、0.5%,0.75%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%;若落在1%~10%之间，则 应稀释成1%、2%、4%、6%、8%、10%),按6所述再测一遍;这 6~9个浓度，也可通过查对数表，按等 对数间距原则自行确定（例如，若落在1%~10%之间，则应稀释成10%、6.31%、3.98%、2.51%、 1.58%、1.00%，它们的对数相应为1.00、0.80、0.60,0.40、0.20.0.00,对数间距均为0.2)。 6 测定 6.1测定条件 6.1.1室温 室温20~25℃。 同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过土1℃。且所有测试器Ⅲ及试剂、溶液测前 1 h 均置 于控温的测试室内。 6.1.2 pH 若须测定包括pH影响在内的急性毒性，不应调节水样pH。 若须测定排除 pH 影响在内的急性毒性,须将水样和 CK(氯化钠3g/100 ml)pH测前调至下值：主 要含Cu水样为4.5，主要含其他金属水样为5.4,主要含有机化合物水样为7.0。 6.1.3溶解氧 本法只能测定包括溶解氧影响在内的急性毒性。 6.2测定步骤 6.2.1试管的排列 于塑料或铁制试管架上按以下二种情况排列测试管。 6.2.1.1按5.2.1.3所述，样品母液相对发光度为1%以上者，如下排列； 左侧放参比毒物氯化汞系列浓度溶液管，右侧放样品管。前排放氯化汞溶液和样品管，后一排放对 照（CK)管，后二排放CK预试验管。每管氟化汞或样品液均配一管CK（氯化钠3g/100ml蒸馏水溶 液）。设3次重复。每测一批样品，均须同时配置测定系列浓度氯化汞标准溶液。 表2试管在试管架上的排列 后二排 CK预试1 CKm试2 后一排 CK CK CK CK CK CK CK CK CK CK CK CK CK CK 前排 0. 020. 020.020.040. 040. 04 样1 .. 样孔 管群 氯化汞(mg/L) 样品 6.2.1.2按5.2.1.2所述，样品母液相对发光度为50%以下乃至零者，如下排列： 左侧仅放氯化汞0.10mg/L溶液管（作为检验发光细菌活性是否正常的参考毒物浓度，它反应 15min的相对发光度应在50%左右），右侧放样品稀释液管（从低浓度到高浓度依次排列）。其他同 6.2.1.1。每测一批样品，均须同时配测氯化汞0.10mg/L溶液。 6.2.2加3g/100ml氯化钠溶液 用5ml的定量加液瓶给每支CK管加2或5ml氮化钠3g/100ml(据仪器型号而定）。 6.2.3加样品液 GB/T15441-1995 用2或5ml吸管给每支样品管加2或5ml样品液（据6.2.2而定）。每个样品号换一支吸管。 6.2.4发光细菌冻干菌剂复苏 从冰箱2～5℃室取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓶和氯化钠溶液，投入置有冰块的小号 (1~1.5 L)保温瓶,用 1 ml 注射器吸取0. 5ml 冷的氯化钠2 g/100 ml(适用于 5ml 测试管）或1 ml 冷 的氯化钠2.5%（适用于2ml测试管）注入已开口的冻干粉安颜瓶，务必充分混匀。2min后菌即复苏发 光（可在暗室内检验，肉龈应见微光）。备用。 6.2.5仪器的预热和调零 打开生物发光光度计电源，预热15min，调零，备用。 6.2.6仪器检验复苏发光细菌冻干粉质量 另取一空2或5ml测试管，加2或5ml氯化钠3g/100 m(据6.2.2而定），加10ul复苏发光菌 液，盖上瓶塞，用手颠倒5次以达均匀。拔去瓶塞，将该管放入各自型号