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ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 35912—2018 猪繁殖与呼吸综合征病毒 荧光RT-PCR检测方法 Real-time RT-PCR method for detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 35912—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位:中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中国农业科学院上海兽医研究所、中华 人民共和国深圳出人境检验检疫局、湖南圣湘生物科技有限公司、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人:张强、李健、熊炜、童光志、赵和平、李树清、花群义、杨忠苹、李国新、王巧全, 王艳、林颖、蔡开妹、喻正军、林祥梅、吴绍强。 GB/T 35912—2018 猪繁殖与呼吸综合征病毒 荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测的操作方法。 本标准适用于猪繁殖与呼吸道综合征病毒美洲型毒株核酸检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T25172猪常温精液生产与保存技术规范 3 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Real-timeRT-PCR:荧光反转录聚合酶链式反应(real-time reverse transcriptpolymerase chainre- action) Ct值:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数(cyclethreshold) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) Taq酶:Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) TE缓冲液:Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTAbuffer) DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) PRRSV:猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus) PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsolution) 4仪器 4.1 荧光PCR检测仪。 4.2 高速台式冷冻离心机:可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。 4.3 组织研磨器或者研钵。 4.4普通冰箱:2℃~8℃。 4.5超低温冰箱:可控温至一70℃以下。 4.6 配备与移液器匹配的吸头。 4.7高压灭菌锅。 1 GB/T35912—2018 5耗材 5.11.5mL无RNA酶离心管 5.20.2mLPCR薄壁管或八联管。 6试剂 6.1除非另有说明,在检测中使用的试剂均为分析纯,实验室用水应符合GB/T6682的要求。 6.2Trizol,商品化RNA抽提试剂,4℃8℃保存。 6.3 氯仿:常温保存。 6.4吴 异丙醇:使用前预冷至一20℃。 6.5 5无水乙醇:20℃预冷 6.6 675%乙醇:无水乙醇和双蒸水配制,一20℃预冷。 DEPC水:配制见A.1,也可购买商品化DEPC水。 6.8 PBS:配制见A.2。 6.9 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液:Taq酶浓度为5U/μL,Taq酶反应缓冲液中Mg2+浓度 为15mmol/L。 6.10逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液:逆转录酶浓度为50U/μL,一20℃保存,避免反复冻融。 6.11 RNA酶抑制剂(40U/uL):一20℃保存,避免反复冻融 6.12 dNTPs:含dATP,dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L,一20℃保存,避免反复冻融。 6.13 引物和TaqMan探针,其序列见附录B。 6.14猪繁殖与呼吸道综合征病毒阳性对照样品和阴性对照样品:阳性对照为非感染性体外转录 RNA;阴性对照为健康猪的组织材料。 6.15内参照质粒:带有人β-珠蛋白基因的质粒。 7样品采集和处理 7.1买 采样工具 7.1.1手术刀、剪刀、镊子,经160℃干热灭菌2h。 7.1.2注射器。 7.1.3一次性无菌采样拭子。 7.1.4组织研磨器或者研钵,经160℃干热灭菌2h。 7.1.5真空采血管。 7.2 样品采集 7.2.1血清样品采集:用无菌注射器抽取受检猪静脉血不少于5mL,置于无菌离心管内,室温或者 37℃倾斜放置自然凝集20min~30min,2000r/min~3000r/min离心10min,吸取上清液到新的离 心管内备用。 7.2.2公猪精液:按照GB/T25172的方法采集和保存精液 7.2.3口腔拭子:大猪使用保定器保定,小猪可以双手保定,用采样拭子蘸取口腔分泌物,放人无菌采 样管中。 7.2.4肺灌洗液:完整摘取肺脏/肺叶,送实验室进行灌洗。 2 GB/T35912—2018 7.2.6细胞培养物:细胞培养物反复冻融3次,第3次解冻后,将细胞培养物置于1.5mL无RNA酶的 灭菌离心管内,编号备用。 7.3样品保存和运输 7.3.1上述采集的样品可立即用于检测。不能立即检测的样品,在2℃~8℃下保存应不超过24h, 一20℃士5℃下应不超过3个月,一70℃以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行运输,并在规 定温度下的保存期内送达 7.4样品处理 7.4.1血清和精液样品无需进行前处理,直接用于核酸提取。 7.4.2口腔拭子样品:加入500uL无菌PBS,充分涡旋震荡1min,反复挤压拭子,弃去拭子后 3000r/min离心5min,取上清用于后续的核酸提取。 7.4.3肺灌洗液:根据肺脏/肺叶的大小,通过肺管加人5mL~10mL无菌PBS,反复揉捏,吸取灌洗 液,3000r/min离心5min,取上清用于核酸提取 7.4.4组织样品:取1g组织,剪碎,加人2mL生理盐水进行研磨,制备组织匀浆,8000r/min离心 5min,取上清用于后续的核酸提取。 7.4.5细胞培养物:4000r/min,4℃离心10min,取上清用于后续的核酸提取。 8荧光RT-PCR操作程序 8.1RNA抽提 8.1.1在核酸提取区操作。RNA抽提使用Trizol手工提取,也可以使用等效的商品化试剂盒。 8.1.2取n个灭菌的1.5mL无RNA酶离心管,其中n为待检样品数十阳性对照十阴性对照,对每个 离心管进行编号。 8.1.3每管先加人600μLTrizol裂解液,再分别加人被检样品、阳性对照、阴性对照各200μL,颠倒 10次混匀,最后加人200μL氯仿,涡旋震荡5s,4℃条件下12000r/min离心15min。 8.1.4将上层透明液体(约400μL)转移到一个新的无RNA酶的离心管中,加入等体积预冷的异丙醇, 每个离心管对应编号。 8.1.512000r/min离心15min,弃去上清,沿管壁缓缓加人0.8mL~1mL75%乙醇,颠倒3~6次混 残液。 8.1.6加人20uLDEPC水,轻轻混匀,溶解RNA。提取的RNA应尽快进行反转录扩增或放置于 一70℃冰箱保存。 纸上的不同位置。 8.2荧光PCR检测 8.2.1反应体系的配制 在试剂配制区进行。设实时荧光PCR反应管数为n,n为待检样品数十阳性管数十阴性管数,每 个反应的体系见附录C,为了避免移液器取样损失,建议按n十1个反应进行配制。配制反应液在冰盒 中进行。 3
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