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ICS07.080 A20 中华人民共和国国家标准 GB/T 40187—2021 核酸适配体亲和性和特异性评价技术导则 Technical guidance for affinity and specific of aptamer 2021-05-21发布 2021-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 40187—2021 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国标准化研究院归口。 大学、河北农业大学、西南大学、浙江工商大学、河南大学、北京食品科学研究院、河北医科大学。 本标准主要起草人:张岩、周巍、马爱进、王周平、瞿昊、罗昭锋、郑磊、王向红、陈佳、马良、田益玲、 王赞、张雅伦、张涛、康文艺、王彦波、傅玲琳、孙勇、陈伟、吕品。 GB/T 40187—2021 核酸适配体亲和性和特异性评价技术导则 1范围 本标准适用于金属离子、小分子、大分子、细胞及颗粒物、组织以及混合目标物等不同层次目标物体 系的核酸适配体的亲和性和特异性评价。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 亲和性 affinity 特定目标物与核酸适配体之间相适应而存在的引力,它是特定目标物与核酸适配体固有的结合力 注:亲和性的强弱,一般以平衡解离常数KD来表示 3.2 特异性 specificity 相同测定方法、相同物质的量浓度等条件下,测定核酸适配体对目标物及其非目标物的结合数 量比。 注:当结合数量比值越高,说明特异性越好。 3.3 平衡解离常数 disocciation constant 核酸适配体与目标物结合达到解离平衡时各产物浓度的幂函数的乘积除以反应物浓度的幂函数。 注:绝大多数情况下,核酸适配体与目标物是1:1结合,核酸适配体的平衡解离常数可以简化为溶液中游离状态 的核酸适配体浓度与游离状态的目标物物质浓度的乘积再除以两者复合物的浓度。数值上等于目标物物质被 核酸适配体结合一半时目标物物质的浓度(Kp)。KD值越小,表明两者相互作用越强 KD=CACT CE 式中: K 平衡解离常数; 核酸适配体的物质的量浓度; CT 目标物分子物质的量浓度; 复合物的物质的量浓度。 CE 1 GB/T40187—2021 4评价规则 4.1亲和性 用核酸适配体与目标物结合的平衡解离常数(Kp)来表示核酸适配体与目标物亲和性的强弱。Kp 值越低表明其亲和性越强。金属离子、小分子与核酸适配体复合物的KD值一般在数十纳摩尔每升至 微摩尔每升范围之内;大分子、细胞、组织与核酸适配体复合物的Kp值一般在皮摩尔/升至纳摩尔每升 范围之内。 4.2特异性 给定条件下分别测定核酸适配体对目标物及其非目标物的结合数量比。对不同非目标物具有不同 的特异性,当比值大于3时一般认为具有特异性 5测定方法 5.1测定方法质量控制 测试过程应添加阴性对照,包括目标物的阴性对照和核酸适配体的阴性对照。目标物的阴性对照 尽量选择与目标物结构类似、来源相近的非目标物;核酸适配体的阴性对照建议选择碱基数量相同的无 种方法的基本原理及适用范围。 5.2亲和性测定方法 5.2.1无需复合物与未结合适配体分离的测定方法 无需复合物与未结合适配体分离是指不需要将复合物从检测体系中分离出来,根据相应测试信号 变化实现亲和性测定。此类方法适用于结合前后产生光谱信号或热量变化与目标物或核酸适配体浓度 呈正相关性的体系。方法包括荧光光谱法、紫外吸收法、等温滴定微量热法、微量热泳动法等。荧光光 谱法、紫外吸收法多适用于金属离子、小分子测定;等温滴定微量热法、微量热泳动法多适用于小分子、 大分子测定。 5.2.2需要复合物与未结合适配体分离的测定方法 需要复合物与未结合适配体分离是指需要将复合物从检测体系中分离出来,根据相应测试信号变 化实现亲和性测定。此类方法适用于只有通过分离才能实现复合物定量的体系。方法包括荧光光谱 法、微球分离法、流式细胞术、酶联核酸适配体法、表面等离子体共振法、生物膜干涉法、毛细管电泳、凝 胶阻滞电泳等分子互作分析方法。荧光光谱法多适用于细胞、组织等的测定;流式细胞术多适用于大分 子、细胞等的测定;酶联核酸适配体法多适用于小分子、大分子、细菌、病毒等的测定;表面等离子体共振 法、生物膜十涉法多适用于小分子、天分子和细胞等的测定;毛细管电泳、凝胶阻滞电泳多适用于大分子 和细胞等的测定:微球分离法多结合荧光光谱、荧光定量聚合酶链式反应(PCR)等适用于小分子、大分 子等的测定。 5.3特异性测定方法 相同条件下(相同测定方法、相同物质的量浓度等条件)根据5.2的方法进行测定,计算核酸适配体 对目标物及其非目标物的结合数量比。 2 GB/T 40187—2021 6 防污染措施 检测过程用水规格和试验方法按照GB/T6682中的规定执行,防止交叉污染的措施按照GB/T27403 中的规定执行。 GB/T 40187—2021 6 防污染措施 检测过程用水规格和试验方法按照GB/T6682中的规定执行,防止交叉污染的措施按照GB/T27403 中的规定执行。 GB/T 40187—2021 6 防污染措施 检测过程用水规格和试验方法按照GB/T6682中的规定执行,防止交叉污染的措施按照GB/T27403 中的规定执行。
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