ICS 71.040.40 G 04 中华人民共和国国家标准 GB/T 35098—2018 微束分析 透射电子显微术 植物病毒 形态学的透射电子显微镜鉴定方法 Microbeam analysis-Transmission electron microscopy- Morphological identification method of plant viruses by transmission electron microscopy 2019-04-01实施 2018-05-14发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35098—2018 目 次 前言 引言 范围 规范性引用文件 3 术语和定义 基本原理 4 仪器设备、试剂和材料、环境条件 6 试样 透射电子显微镜鉴定步骤 7 植物病毒形态学鉴定结果的质量要求 鉴定报告发布 9 10 除害处理· 附录A（资料性附录）常用试剂的配方 附录B（资料性附录）植物病毒各科、属的形态学和细胞病理学特征 参考文献 GB/T35098—2018 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草， 本标准由全国微束分析标准化技术委员会（SAC/TC38）提出并归口。 本标准起草单位：浙江大学、云南省农业科学院、浙江省农业科学院 本标准主要起草人：洪健、张仲凯、谢礼、吴建祥、钱亚娟、周雪平。 GB/T35098—2018 引言 植物病毒是一类侵染被子植物、裸子植物和蕨类植物的重要病原生物，在全世界范围内引起农作 物、果树、花卉、牧草、药用植物的病害，造成产量和品质下降，严重影响人类的生产生活。2016年国际 病毒分类委员会（InternationalCommitteeforTaxonomyofViruses，ICTV）公布的植物病毒涉及4个 等分子生物学证据可以诊断鉴定病毒到科、属、种。由于植物病毒个体小至数十纳米，可借助透射电子 显微镜方能观察到其形态。为了规范植物病毒形态学检测的技术方法，正确指导植物病毒病原的诊断 和鉴定工作，有必要制定植物病毒透射电子显微镜形态学鉴定方法的国家标准。 Ⅱ GB/T350982018 微束分析透射电子显微术植物病毒 形态学的透射电子显微镜鉴定方法 1范围 本标准规定了使用透射电子显微镜对植物病毒进行形态学观察和鉴定的步骤、质量要求及鉴定报 告的发布。 本标准适用于各种类型透射电镜对植物病毒形态的观察和鉴定。 2规范性引用文件 2 SZIG 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 SN/T2964植物病毒检测规范 术语和定义 3 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 病毒virus 由核酸和蛋白质外壳组成且具有侵染活性并能够在细胞内自我复制的病原生物。 3.2 病毒粒子virion 成熟的或结构完整、有感染性的病毒个体。 3.3 衣壳 capsid 由集合的蛋白质亚单位组成并包围核酸基因组的对称蛋白质外壳。 3.4 核衣壳 nucleocapsid 由包围病毒核酸的蛋白质衣壳与核酸形成的组合体。 3.5 内含体 inclusion body 病毒侵染后在寄主细胞中产生的由病毒或者细胞组分共同构成的异常结构。 注：在光学显微镜或透射电镜下内含体显示不同的形态特征。 3.6 抗原 原antigen 能刺激动物机体产生抗体和致敏淋巴细胞并能与之发生特异性免疫结合反应的物质。 1 GB/T350982018 3.7 抗体antibody 动物机体受到抗原刺激而产生的、能与相应抗原发生特异性免疫结合反应的免疫球蛋白。 3.8 负染色 negative stain 采用高密度的重金属盐染色液提高试样颗粒背景电子密度的染色方法。 3.9 免疫电子显微术 immunoelectronmicroscopy 3.10 超薄切片1 ultrathin section 采用超薄切片机切成的厚度为50nm～100nm的生物试样薄片。 4基本原理 试样周围的电子密度得到增强，在透射电镜下显示暗背景衬托的浅色试样形态及微细结构，图像呈现负 反差。该方法直接对病毒悬液试样进行负染色，操作简便，分辨率高，可用于病毒快速诊断。 4.2免疫电子显微术原理：免疫电子显微术分为免疫复合物电镜技术和免疫标记技术两大类。免疫复 合物电镜技术是对电镜载网上形成的抗原抗体免疫反应复合物进行负染色后直接电镜观察，其中免疫 吸附法具有富集病毒的作用，免疫修饰法具有血清学相关性识别的作用，适用于病毒快速诊断。免疫标 记技术是以抗体连接标记物（如胶体金）作为探针，对细胞表面或细胞内部的相应抗原进行定位、定性及 半定量测定 4.3超薄切片技术原理：将经过固定的生物试样包埋在树脂介质中，采用超薄切片机将固化的试样包 埋块切成厚度为50nm～100nm的薄片，供透射电镜观察用。 5 仪器设备、试剂和材料、环境条件 5.1 仪器设备 5.1.1 透射电子显微镜。 5.1.2 超薄切片机。 5.1.3 玻璃制刀机。 5.1.4 超薄切片钻石刀或玻璃刀。 5.1.5 高速离心机。 5.1.6 正置光学显微镜 5.1.7 研钵。 5.1.8 微型研磨器。 5.1.9 涡旋振荡仪。 5.1.10 辉光放电仪。 5.1.11 移液器（20μL,200μL）。 5.2 试剂和材料 5.2.1 磷酸二氢钠（分析纯）。 2 GB/T350982018 5.2.2磷酸氢二钠（分析纯）。 5.2.3） 戊二醛（分析纯）。 5.2.4 四氧化钱（结晶体）。 5.2.5 丙酮（分析纯）。 5.2.6 乙醇（分析纯）。 5.2.7 环氧树脂包埋剂。 5.2.8 醋酸双氧铀（分析纯）。 5.2.9 柠檬酸铅（分析纯）。 5.2.10 磷钨酸（分析纯）。 5.2.11 钼酸铵（分析纯）。 5.2.12 亚甲基蓝。 5.2.13 病毒多克隆抗体。 5.2.14 PCR检测离心管(0.5mL,1.5mL)。 5.2.15 封口膜。 5.2.16 包埋管。 5.2.17 硅胶包埋板。 5.2.18 覆Formvar膜的电镜载网。 5.3 3环境条件 超薄切片机、透射电镜应安装在独立的房间内，工作环境应符合以下要求： a） 超薄切片机：相对湿度小于60%，温度（20土5）℃，电源电压（220土22）V，电源频率（50土 1）Hz，满足防震要求 b) 透射电镜：相对湿度小于60%，温度（20土5）℃，电源电压（220土22）V，电源频率（50士 1）Hz，具备仪器专用地线，接地电阻值参照仪器说明书的要求。 6试样 6.1 试样来源 6.1.13 分离提纯的植物病毒悬浮液 6.1.2 人工接种病毒的鉴别寄主和繁殖寄主植物 6.1.3 田间受植物病毒侵染的叶、茎、花、根等新鲜材料。 6.1.4植物种子、球茎、苗木等繁殖材料。 6.1.5植物组织培养苗。 6.2 取样要求 6.2.1 田间作物和人工接种植物的取样及试样处理按照SN/T2964的规定执行 6.2.2 进出境植物检疫的取样按照SN/T2122的规定执行。 6.3试样预处理 6.3.1 组织粗汁液试样：将呈现明显感病症状或者隐症的植物组织以1g加2mL的比例加人 0.05mol/L磷酸缓冲液（pH值7.0），在研钵中研磨，过滤或离心后获得粗汁液。小片组织可用微型研 磨器研磨，或者用手挤出组织汁液，或者压破叶表皮获得组织汁液。种子剥皮去仁后，将种皮于液氮中 研磨制备组织粗汁液，也可以在适当温度和光照条件下使其发芽后再制备获取组织粗汁液。磷酸缓冲 3