说明:收录25万 73个行业的国家标准 支持批量下载
ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T36852—2018 亚洲梨火疫病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Erwinia pyrifoliae 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36852—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、南京农业大学、中华人民共和国上海出人境检验检疫 局、浙江大学、中华人民共和国烟台出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:赵文军、田茜、胡白石、田艳丽、易建平、楼兵干、李红叶、葛泉卿。 GB/T36852—2018 亚洲梨火疫病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了亚洲梨火疫病菌的分离培养、免疫学及分子生物学等检测方法 监测。 2 亚洲梨火疫病菌基本信息 中文名:亚洲梨火疫病菌 学名:Erwinia pyrifoliae Kim et al. 英文名:Shootblightof Asianpear 菌目(Enterobacteriales),肠杆菌科(Enterobacteriaceae),欧文氏菌属(Erwinia)。 传播途径:染病的梨的繁殖材料(包括种苗、木和接穗)、昆虫、风、雨、以及被污染的包装材料和运 输工具等许多自然因素和人为因素都可引起亚洲梨火疫病的传播。其中,染病的梨的繁殖材料是亚洲 梨火疫病远距离传播的主要途径。 亚洲梨火疫病菌的其他信息参见附录A。 3方法原理 根据亚洲梨火疫病菌与抗体之间的特异性反应进行免疫学检测;根据亚洲梨火疫病菌的特异性 DNA序列进行分子生物学检测;根据亚洲梨火疫病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围及危害症状等 对病原菌进行分离培养及致病性测定。 4仪器设备和主要试剂 4.1仪器设备及用具 超净工作台、恒温培养箱、摇床、超低温冰箱、常规冰箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、小型离心机、高速 冷冻离心机、显微镜、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、制冰机、电子天 平、涡旋振荡器、微量进样器、烘箱等。 4.2主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯。分子生物学检测所需试剂见附录B和附录C。 5检疫鉴定方法 5 5.1症状检查 参照附录A中的症状描述检查植株有无亚洲梨火疫病的典型症状,主要检查嫩梢、花、幼果和枝干 1 GB/T36852—2018 等部位。观察嫩梢是否出现萎焉(拐杖状)、变黑枯死;花和幼果是否变黑枯死;叶脉是否从叶柄基部向 上变黑;枝干是否有溃疡斑;以及病组织上是否有菌脓。对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记 录,并采集表现症状的嫩梢、花簇、枝干,幼果等送实验室检测鉴定。对于无症的幼嫩枝条,应重点对其 顶端和基部取样。 5.2样品的制备 5.2.1显症植株样品的制备 疑似样本采集后应尽快检测,若不能及时检测,样本应在4℃~8℃下保存,尽可能不要超过一周。 采集样品以及在运输和处理过程中应注意避免交叉污染。 样品处理应采用对分离培养、免疫学和分子生物学检测都有效的通用程序。为了成功进行富集,要 使用新制备的抗氧化剂浸渍缓冲液[聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-10,20g;甘露醇,10g;抗坏血酸,1.76g; 还原型谷胱甘肽,3g;磷酸盐缓冲液(PBS),10mM,1L;pH7.2;过滤除菌」。样品也可以用无菌蒸留 水或pH7.2的PBS(NaCl,8g;KCl,0.2gNazHPO·12H,O,2.9g;KH,PO4.0.2g;蒸馏水,1L)处 理,直接用于分离培养、免疫学或分子生物学检测。 应尽可能选择表现出最典型症状并带有菌浓的植物部位(花朵、嫩梢、幼枝、叶片或果实)。处理用 的材料挑取病健交界部位,将植物组织切成大约0.1g1.0g的小块,放入装有适量抗氧化剂浸渍缓冲 液、PBS或无菌蒸留水的离心管或培养血中轻轻挤压,静置至少5min,并在冰块上放置儿分钟,即制成 样品悬浮液,用于后续分离培养、免疫学检测及分子生物学检测。 5.2.2无症植株样品的制备 无症状样品可单个处理(最好如此),或者最多10个一组。采集样品时和提取过程中应小心避免交 叉污染。 在3月下旬到6月底,即梨树开花期开始到果实膨大中期,采集花器、幼果幼梢枝段,装人无菌袋或 容器中。从疑似植株上剪下长度约为20cm的嫩梢,或花期时的花器。如果在冬天进行分析,要从每株 叶片的叶柄基部,或茎段。称取0.1g~1.0g植物材料,浸渍在按照5.2.1描述抗氧化剂缓冲液中,制成 样品悬浮液。 因为细菌菌群少,对无症状样品直接进行检测时通常对亚洲梨火疫病菌表现为阴性。因此,在检测 无症状材料时,应在25℃左右对用抗氧化剂缓冲液制备的样品进行72h富集。 建议使用两种经过验证的液体培养基进行富集,一种为非选择性(金氏B培养基),另一种为半选 择性(CCT培养基)。取制备的样品浸出液0.9mL分别加人两个各装有0.9mL液体富集培养基(无琼 脂的金氏B和使用营养肉汤而非营养琼脂制备的CCT培养基)的10mL~15mL的无菌试管中(确保 通风良好)。试管在25℃下无震荡培养48h~72h。在处理冬天采集的植物样品时建议培养更长时 间。取适量样品富集培养液用于后续分离培养、免疫学检测及分子生物学检测。 CCT培养基分两部分制备。第一部分含:蔗糖,100g;山梨糖醇,10g;硫酸四癸钠,1.2mL;结晶 紫,2mL(0.1%乙醇溶剂);营养琼脂,23g;蒸馏水,1L;pH7.0~7.2115℃高压灭菌10min。将灭过 菌的培养基冷却至大约45℃。第二部分含:硝酸铊2mL(质量浓度为10g/L);放线菌酮,0.05g;过滤 除菌。将第二部分加入1L无菌的第一部分培养基中。 金氏B培养基含:蛋白陈,20g;甘油,10mL;K,HPO,1.5g;MgSO:7HzO,1.5g;琼脂,15g;蒸 馏水,1LpH7.0~7.2;120℃高压灭菌20min。 5.3免疫学检测 采用商品化ELISA方法进行检测,按照说明书进行操作及结果判定。若检测结果为阴性,直接判 2 GB/T36852—2018 定为未检出亚洲梨火疫病菌。若检测结果为阳性,需进行分离培养鉴定及致病性测定。亦可不进行免 疫学检测,直接进行分子生物学检测。 5.4分子生物学检测 5.4.1模板制备 对于植株样品,按照步骤5.2的方法制备成样品悬浮液或样品富集培养液后,直接用商业化植物基 10min,取上清液,一20℃保存)作为分子生物学检测反应模板。 5.4.2PCR凝胶电泳检测 以E.pyrifoliae标准菌株作阳性对照,用非E.pyrifoliae的植物细菌作阴性对照,以双蒸水代替 除因核酸提取失败、降解,或因存在PCR抑制剂而引起PCR假阴性的可能性。具体检测步骤见附 录 B。 5.4.3实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测具体步骤见附录C,对照及植物内对照设置同5.4.2。 5.5分离培养鉴定 按照5.2的方法制备成样品悬浮液或样品富集培养液后,用灭菌接种环蘸取悬浮液在溶菌肉汤 (LB)培养基平板上划线分离,或者用无菌水对样品悬浮液进行10倍梯度稀释,各取100μL稀释液涂 板分离,各重复3次。25℃恒温培养24h~48h,挑取可疑单菌落进行纯化,转接2次~3次,随后进行 致病性测定、Biolog鉴定、免疫学或分子生物学鉴定。 在LB培养基上,亚洲梨火疫病菌形成与梨火疫病菌相似的乳白色菌落,但梨火疫病菌在LB蔗糖 果聚糖,菌落较小略有凸起。常见的污染菌草生欧文氏菌Eriniaherbicola在LB上形成黄色菌落, 因此可以排除 LB培养基配制方法:胰蛋白陈10g,酵母浸膏5g,氯化钠10g,琼脂15g,加双蒸水至1000mL, 调节pH至7.5,湿热灭菌(121℃,15min)。 5.6Biolog鉴定 利用Biolog微生物自动鉴定系统对分离纯化的菌株进行鉴定,按照说明书进行操作及结果判定。 5.7致病性测定 5.7.1幼果接种试验 取梨幼果(直径大约3cm~5cm)洗净晾干,用灭菌刀片横切果实,置垫有灭菌滤纸的培养皿上(加 少量无菌水)。用接种针蘸取在LB培养基上培养24h~36h的待鉴定菌落,针刺接种到幼果的果肉组 织,一个横切面接种3个点~4个点。接种后,26℃保湿培养,诱导发病和菌脓的形成。大约24h后, 观察接种部位有无坏死和菌脓产生。实验以无菌水为对照。 5.7.2枝梢接种试验 剪取梨树当年生的幼嫩枝梢,插于盛有自来水的三角瓶中,用接种针蘸取在LB培养基上培养24h~ 3 GB/T36852—2018 36h的待鉴定菌落,刺伤接种到顶端生长点下约5cm~10cm处;也可刺伤后,在刺伤点接种1滴 (3μL~5μL)浓度为10CFU/mL的病菌悬浮液。接种后套袋25℃C左右保湿培养,2d~3d后观察接 种点是否出现变黑、组织干癌、枝梢萎為等症状及是否出现菌脓。 6结果判定 依据表1进行检测结果判定。 表 1 免疫学或分子 Biolog鉴定 分离培养鉴定 致病性测定 结果判定 生物学检测 (可选) 任一方法阳性 阳性 阳性 阳性 样品检出亚洲梨火疫病菌 任一方法阳性 阴性 样品未检出亚洲梨火疫病菌 任一方法阴性 样品未检出亚洲梨火疫病菌 一 其中,分子生物学检测可根据实验室条件,选择5.4.2或5.4.3中的任意一种进行检测,任意一种检 测方法的结果为阳性则判定分

pdf文档 GB-T 36852-2018 亚洲梨火疫病菌检疫鉴定方法

文档预览
中文文档 12 页 50 下载 1000 浏览 0 评论 0 收藏 3.0分
温馨提示:本文档共12页,可预览 3 页,如浏览全部内容或当前文档出现乱码,可开通会员下载原始文档
GB-T 36852-2018 亚洲梨火疫病菌检疫鉴定方法 第 1 页 GB-T 36852-2018 亚洲梨火疫病菌检疫鉴定方法 第 2 页 GB-T 36852-2018 亚洲梨火疫病菌检疫鉴定方法 第 3 页
下载文档到电脑,方便使用
本文档由 思安 于 2023-01-26 17:30:15上传分享
站内资源均来自网友分享或网络收集整理,若无意中侵犯到您的权利,敬请联系我们微信(点击查看客服),我们将及时删除相关资源。