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ICS65.020.30 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T15805.4—2018 代替GB/T15805.4—2008 斑点叉尾病毒病诊断规程 Code of diagnosis for channel catfish virus diseases 2018-07-13发布 2019-02-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T15805.4—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替GB/T15805.4—2008《鱼类检疫方法 第4部分:斑点叉尾病毒(CCV)》。本标准 与GB/T15805.4一2008相比,除编辑性修改外,主要技术变化如下: 一增加了斑点叉尾鲫病毒病的临床症状描述; 一增加了酶联免疫吸附试验检测斑点叉尾病毒抗原的方法; 改为酚氯仿法抽提病毒核酸; —PCR检测增加内控DNA,长度为186bp; 增加了资料性附录C"斑点叉尾鲫病毒病(CCVD)”。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。 本标准起草单位:全国水产技术推广总站、中国检验检疫科学研究院、北京出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:吕永辉、张曼、王娜、谷强、余卫忠、景宏丽、张利峰、徐晔、周毅 本标准所代替标准的历次版本发布情况为: GB/T15805.1—1995; GB/T15805.4—2008。 1 GB/T15805.4—2018 斑点叉尾病毒病诊断规程 1范围 本标准规定了斑点叉尾病毒病临床症状、组织病理学特征、病毒分离,中和试验、酶联免疫吸附试 验检测和聚合酶链式反应检测的方法。 本标准适用于斑点叉尾鲫病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 SC/T7016.8鱼类细胞系第8部分:斑点叉尾鲫卵巢细胞系(CCO) SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp:碱基对(basepair) CCO:斑点叉尾鲫卵巢细胞(channelcatfishovarycell line) CCV:斑点叉尾鲫病毒(channel catfish virus) CCVD:斑点叉尾病毒病(channelcatfishvirusdisease) CPE:细胞病变效应(cytopathiceffect) dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate) dCTP:脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphate) dGTP:脱氧鸟苷三磷酸三钠(deoxyaguanosinetriphosphate) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate) dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate) EB:漠溴化乙啶(ethidiumbromide) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid) ELISA:酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay) FBS:胎牛血清(fetalbovineserum) IgG:免疫球蛋白G(immunoglobulinG) OD:光密度(opticaldelnsity) OPD:邻苯二胺(o-phenylenediamine) PBST:磷酸盐吐温缓冲液(phosphatebuffersolution-tween-20) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) 1 GB/T15805.4—2018 Taq:水生栖热菌(thermusaquaticus) TBE:三羟甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸缓冲液(tris-Borate-EDTA) TCIDso:半数组织培养感染剂量(tissuecultureinfectivedose) TMB:3,3'5,5'-四甲基联苯胺(33',5,5'-Tetramethylbenzidine) Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane」 4试剂和材料 4.1Taq酶:5U/μL。一20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.2dNTP:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L,-20℃保存。 4.3无水乙醇:分析纯,使用前预冷到一20℃。 4.43 琼脂糖:电泳级。 4.5 5青霉素:100mg/mL。 4.6 链霉素:50mg/mL。 4.7 过氧化氢:3%。 4.8 Tris饱和酚:pH8.0。 4.9 氯仿:又称三氯甲烷,分析纯。 4.10 异戊醇:分析纯。 4.11 矿物油:PCR级。 4.12 溴酚蓝:分析纯。 4.13 水:应符合GB/T6682中一级水的规格 4.14 CCV参考株(阳性对照):由农业部相关部门指定机构提供。 4.15 羊抗CCV的IgG和抗血清:由农业部相关部门指定机构提供, 4.16 鼠抗CCV的单克隆抗体:由农业部相关部门指定机构提供 4.17 斑点叉尾鲫卵巢细胞,应符合SC/T7016.8的规定,培养液见附录A中A.1,细胞消化液见A.2。 4.18 内控DNA,是一段长186bp的人工合成DNA片段,其两端的序列和CCV的引物序列互补。由 检测实验室自已合成,或购买商品化试剂,序列参见附录B中B.1。 4.19 封闭液:1%明胶。 4.20 包埋稀释液:pH9.6,见A.3。 4.21 PBST:PBS(磷酸盐缓冲液,见A.4),加人0.05%Tween-20,见A.5。 4.22 TMB:显色液,配方见A.6。 4.23 底物缓冲液:pH5.0柠檬酸-磷酸缓冲液,见A.7,用于配制显色底物(见A.8)。 4.24 终止液:2mol/L的硫酸,见A.9。 4.25 蛋白酶K缓冲液:0.5mg/mL,见A.10。 4.26 TBE电泳缓冲液:pH8.0,见A.11。 4.27 引物:浓度为50pmol/μL。引物序列: F: 5'-TCA TCC GAA TCC GAC AAC TGA-3'; R: 5'-CCA AGA TCG CGG AGA AAC-3。 扩增CCV蛋白激酶基因序列中136bp片段。 5器材和设备 5 5.1倒置显微镜 2 GB/T15805.42018 5.2生化培养箱。 5.3普通冰箱和超低温冰箱。 5.4 离心机和离心管。 超净工作台。 5.6 PCR仪。 5.7 电泳仪。 5.8 凝胶成像仪。 5.9 酶标仪。 临床症状和组织病理学特征 9 参见附录C。 7采样 7.1采样对象 斑点叉尾。 7.2 采样水温与数量 采样时水温应在20℃以上。采样数量应符合SC/T7103的要求。 7.3 样品采集 按GB/T18088的规定执行。对有临床症状的鱼,体长<4cm的鱼苗,取整条鱼,若是带卵黄囊的 鱼应去掉卵黄囊;体长4cm~6cm的鱼苗取内脏(包括肾);体长大于6cm的鱼则取肝、肾和脾。对无 症状的鱼取肝、肾和脾;成熟雌鱼还需取卵巢液;鱼卵则取卵膜 8病毒分离 8.1 样品处理 CCV的分离,无临床症状的成鱼,5尾~15尾为一个样品,有临床症状的成鱼每1尾为1个样品 先用组织研磨器将样品勺浆成糊状,按1:10的最终稀释度重悬于含有1000IU/mL青霉素和 1000μg/mL链霉素的培养液中。25℃下孵育2h~4h,或4℃下孵育过夜,以释放病毒。8000g离 心20min,收集上清液 8.2病毒分离 8.2.1 用细胞培养液对1:10的组织匀浆上清液再作2次10倍稀释,然后将1:10,1:100和 1:1000三个稀释度的上清液分别接种到生长约24h的CCO单层细胞上(96孔板中),每稀释度至少 2孔,每孔接种100μL。25℃30℃吸附1h后,不弃去接种液,直接加人100μL细胞培养液,置于 25℃~30℃培养。试验中要有2孔阳性对照(接种CCV参考株),和阴性对照(未接种病毒的细胞)。 倒置显微镜检查 8.2.3如果待检样品没有CPE出现,则还要盲传一次,然后进行鉴定 3. GB/T15805.4—2018 收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层,继续置于25℃~30℃培养7天。每天用40倍~100倍 倒置显微镜检查。 8.3结果判定 在阴性对照细胞始终正常,阳性对照细胞出现了CPE的情况下,当接种了被检上清稀释液的细胞 出现CPE时,为病毒分离阳性,需要立即取病毒悬液用下述任意一种方法进行CCV鉴定。如果样品经 过接种细胞和盲传后均没有CPE出现,则结果判断为阴性。如果阳性对照也未出现CPE,则实验失败。 应换用新的CCO细胞和一批新的组织样品重新进行病毒分离。 9中和试验 9.1收集出现CPE的待检样品病毒液,反复冻融2次后,2000g4℃离心15min去除细胞碎片。 9.2将含病毒的上清液系列稀释到10-4。 9.3每稀释度的病毒液与等体积的抗CCV抗血清混合,同时另取这些病毒稀释液与等体积的细胞培 9.4同时,取参考毒株作为阳性对照,取

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