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ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T 14701—2019 代替GB/T14701—2002 饲料中维生素B2的测定 Determination of vitamin B in feeds 2020-01-01实施 2019-06-04发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 14701—2019 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替GB/T14701—2002《饲料中维生素Bz的测定》。 本标准与GB/T14701一2002相比,主要技术内容修改如下: 修改了方法1、方法2适用范围以及检出限、定量限(见第1章,2002年版的第1章); 规定了不同饲料类型的仲裁法(见第1章,2002年版的第1章); 修改了样品的粉碎粒度(见第3章,2002年版的第3章); 一补充了维生素Bz紫外检测色谱条件下和荧光检测色谱条件下的标准色谱图(见附录A图A.1 和图A.2)。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。 本标准起草单位:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 (北京)]。 本标准主要起草人:李兰、索德成、魏书林。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为: GB/T14701—1993GB/T14701—2002。 1 GB/T 14701—2019 饲料中维生素B2的测定 1范围 本标准规定了饲料中维生素Bz(即核黄素C17H2oN1o)测定的荧光分光光度法和高效液相色谱法 本标准方法1适用于动物性和植物性饲料原料、配合饲料、浓缩饲料中维生素B2的测定,定量限为 0.25 mg/kg. 本标准方法2适用于维生素预混合饲料、复合预混合饲料、浓缩饲料中维生素B2的测定,以荧光检 测器检测时,定量限为5mg/kg;以紫外检测器检测时,定量限为10mg/kg。 浓缩饲料中维生素B2的测定,方法1为仲裁法;维生素预混合饲料、添加剂预混合饲料中维生素 B2的测定,方法2中的高效液相色谱荧光检测器方法为仲裁法。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3方法1荧光分光光度法 3.1原理 维生素Bz(核黄素)在440nm紫外光激发下产生绿色荧光,在一定浓度范围内其荧光强度与核黄 素含量成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质,由还原前后荧光强度之差与荧光强度的比 值计算样品中维生素Bz的含量。 3.2试剂或溶液 除非另有说明,所用试剂均为分析纯试剂,水为蒸馏水,符合GB/T6682中三级用水或相当纯度 的水。 3.2.1氢氧化钠溶液:0.05mol/L。 3.2.2氢氧化钠溶液:1.0mol/L。 3.2.3盐酸溶液:0.1mol/L。 3.2.4盐酸溶液:1.0mol/L。 3.2.5 连二亚硫酸钠(Na,S,O,)。 3.2.6高锰酸钾溶液:40g/L。 3.2.7冰乙酸。 3.2.8冰乙酸溶液,0.02mol/L:将1.8mL冰乙酸用水稀释至1000mL。 3.2.9过氧化氢溶液,100mL/L,分析当天制备。 3.2.10 维生素Bz标准溶液 1 GB/T14701—2019 95%)25mg(精确至0.0001g)于250mL棕色锥形瓶中,加人约200mL冰乙酸溶液(3.2.8),在沸水浴 中煮沸直至溶解,冷却后转移至250mL棕色容量瓶中,用冰乙酸溶液(3.2.8)稀释至刻度。滴加甲苯覆 盖,2℃~8℃冰箱保存,保存期6个月。该溶液含0.1mg/mL维生素Bz。 3.2.10.2维生素Bz贮备液Ⅱ:取维生素Bz贮备液I(3.2.10.1)10mL用冰乙酸溶液(3.2.8)稀释至 100mL,置于棕色容量瓶中滴加甲苯覆盖,2℃~8℃冰箱保存,保存期3个月。该溶液中含10μg/mL 维生素 B2 。 3.2.10.3维生素Bz标准工作液:取维生素Bz贮备液Ⅱ(3.2.10.2)10mL,用水稀释至100mL,分析前 制备。该溶液中含1ug/mL维生素B2。 3.2.11荧光素标准溶液 3.2.11.1荧光素贮备液:称取荧光素0.050g,用水稀释至1000mL,置于棕色瓶中2℃~8℃冰箱保 存。该溶液中含50μg/mL荧光素。 3.2.11.2荧光素标准工作液:取1mL荧光素贮备液(3.2.11.1),用水定容至1000mL,置于棕色瓶中 2℃~8℃冰箱保存。该溶液中含0.05μg/mL荧光素。 3.2.12溴甲酚绿pH指示剂 取溴甲酚绿0.1g,加氢氧化钠溶液(3.2.1)2.8mL溶解,再加水稀释至200mL。变色范围 pH 3.6~5.2。 3.3仪器设备 3.3.1分析天平:感量0.0001g。 3.3.2电热恒温水浴。 3.3.3具塞玻璃刻度试管:15mL。 3.3.4荧光分光光度计。 3.4试样制备 按GB/T14699.1的规定,选取具有代表性的样品至少500g,用四分法缩减至100g;按 GB/T20195的规定制备样品,磨碎,通过0.425mm孔筛,混匀,装人密闭容器中,避光低温保存备用。 3.5 试验步骤 以下操作应避免强光照射。 3.5.1试样溶液的制备 入65mL盐酸溶液(3.2.3),于沸水浴中煮沸30min。在加热开始时,每隔5min~10min摇动锥形瓶 一次,以防试样结块。冷却至室温后,用氢氧化钠溶液(3.2.2)调节pH值至6.0~6.5,立即加盐酸溶液 (3.2.4)使pH值调至4.5(溴甲酚绿指示剂变为草绿色)。转移至100mL棕色容量瓶中,用水稀释至刻 度。通过中速无灰滤纸过滤,弃去最初5mL10mL溶液,收集滤液于100mL棕色锥形瓶中。取整 份清液,滴加稀盐酸检查蛋白质,如有沉淀生成,继续加氢氧化钠溶液,剧烈振摇使之沉淀完全。再次过 滤作为待测试液。 3.5.2杂质氧化 于a、b、c三支15mL刻度试管(3.3.3)中各吸人试样溶液(3.5.1)10mL,同时做平行,向试管a中加 人水1mL,向试管b中加人维生素Bz标准工作液(3.2.10.3)1mL。然后各加人冰乙酸(3.2.7)1mL, 2 GB/T14701—2019 (3.2.9)0.5mL旋摇,使高锰酸钾颜色在10s内消退。加盖摇动,使气泡逸出。 3.5.3测定 用荧光素标准工作液(3.2.11.2)调整荧光仪,使其稳定于一定数值,作为仪器工作的固定条件。调 整激发波长440nm,发射波长525nm,测定试管a、试管b的荧光强度,试样溶液在仪器中受激发照射 不超过10;在试管c中加人20mg连二亚硫酸钠(3.2.5),摇动溶解,并使试管中的气体逸出,迅速测定 其荧光强度作为荧光空白。若溶液出现浑浊,不能读数。 3.6试验数据处理 试样中维生素Bz的含量w以质量分数表示,单位为毫克每千克(mg/kg),按式(1)计算: Wi= Xn ....(1) T,-TAmAV 式中: T一一试管a(试液加水)的荧光强度; T2一试管b(试液加标样)的荧光强度: T3—试管c(试液加连二亚硫酸钠)的荧光强度; m。——加人维生素Bz标样的量,单位为微克(μg); 试液的初始体积,单位为毫升(mL); L Vi 测试时分取试液的体积,单位为毫升(mL); m试样质量,单位为克(g); n 稀释倍数; T-T3 值应在0.66~1.5,否则需调整样液的浓度,调整称样量或者稀释倍数。 T2-Ti 测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留三位有效数字。 3.7精密度 对于维生素Bz含量低于5mg/kg的饲料,在重复性条件下,获得的两次独立测定结果与其算术平 均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的15%; 对于维生素Bz含量大于5mg/kg而小于50mg/kg的饲料,在重复性条件下,获得的两次独立测 定结果与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的10% 对于维生素Bz含量大于50mg/kg的饲料,在重复性条件下,获得的两次独立测定结果与其算术 平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的5%。 4方法2:高效液相色谱法 4.1原理 试样中核黄素经酸性溶液超声提取后,经离心、过滤后的试样溶液注人高效液相色谱仪反相色谱系 统中进行分离,用紫外检测器(二极管矩阵检测器)或荧光检测器检测,外标法计算维生素Bz的含量。 4.2试剂或溶液 除特殊说明外,所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水,色谱用水为去离子水,符合GB/T6682中一级 用水规定。 3

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