(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211049968.4 (22)申请日 2022.08.30 (71)申请人 中国人民解 放军空军 军医大学 地址 710000 陕西省西安市新城区长乐西 路169号 (72)发明人 张燕　张玉梅　李恺　宋文　 何奕德　冀吉昀　李毅　余佳　 艾林　 (74)专利代理 机构 成都顶峰专利事务所(普通 合伙) 51224 专利代理师 钱学宇 (51)Int.Cl. C12Q 1/02(2006.01) G01N 21/01(2006.01) G01N 21/64(2006.01)G02B 21/00(2006.01) G02B 21/34(2006.01) (54)发明名称 利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观 察以及加药刺激的实验方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用倒置激光共聚焦显 微镜进行 活细胞观察以及加药刺激的实验方法， 其包括： 在倒置激光共聚焦显微镜的激光共聚焦 小皿中放置具有中空结构的支撑架， 再将载有活 细胞的片状载体材料倒扣于支撑架上， 并使片状 载体材料上的活细胞位于支 撑架的中空结构处， 以保持片状载体材料的部分待观察面处于自然 悬空状态； 再采用倒置激光共聚焦显微镜的物镜 对处于自然悬空状态的待观察面的活细胞进行 观察。 通过这种方法， 能够避免在观察过程中对 活细胞产生压力， 并给对细胞进行加药刺激， 适 时观察药物对细胞的作用， 从而扩展倒置激光共 聚焦显微镜的适用范围， 提高利用率。 权利要求书1页 说明书6页 附图6页 CN 115521965 A 2022.12.27 CN 115521965 A 1.一种利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的实验方法， 其特征 在于， 其包括： 在倒置激光共聚焦显微镜的激光共聚焦小皿中放置具有中空结构的支撑架， 再将载有 活细胞的片 状载体材料倒扣于所述支撑架上， 并使所述片 状载体材料上的活细胞位于所述 支撑架的中空结构处， 以保持所述片状载体材 料的部分待观察 面处于自然悬空状态； 再采用倒置激光共聚焦显微镜的物镜对处于自然悬空状态的所述待观察面的活细胞 进行观察。 2.根据权利要求1所述的利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的 实验方法， 其特 征在于， 所述支撑架的形状为十 字形、 圆环形或者人字形。 3.根据权利要求2所述的利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的 实验方法， 其特 征在于， 所述支撑架为纯钛金属十 字架。 4.根据权利要求3所述的利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的 实验方法， 其特 征在于， 所述支撑架的厚度为0.3～0.8m m。 5.根据权利要求4所述的利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的 实验方法， 其特 征在于， 所述支撑架的 的厚度为0.45m m或者0.6 5mm。 6.根据权利要求1～5任一项所述的利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及 加药刺激的实验方法， 其特 征在于， 所述物镜为 倍数为20倍或者 40倍。 7.根据权利要求6所述的利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的 实验方法， 其特 征在于， 所述激光共聚焦小皿的型号 为0号。 8.根据权利要求6所述的利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的 实验方法， 其特征在于， 所述支撑架为 厚度为0.45mm的纯钛金属十字架， 所述物镜为40倍激 光共聚焦显微镜； 或者， 所述支撑架为厚度为0.65mm的纯钛金属十字架， 所述物镜为20倍激光共聚焦显 微镜。 9.根据权利要求6所述的利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的 实验方法， 其特 征在于， 所述片状载体材 料为圆形 纯钛金属片。 10.根据权利要求9所述的利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激 的实验方法， 其特征在于， 所述圆形纯钛金属片的表面形貌为5V纳米管， 直径为10mm， 厚为 1mm。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115521965 A 2利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞 观察以及加药刺激的 实验方法 技术领域 [0001]本发明属于细胞观测技术领域， 具体涉及 一种利用倒置激光共聚焦显微镜进行活 细胞观察以及加药刺激的实验方法。 背景技术 [0002]激光共聚焦显微镜是一种非常常见的实验仪器设备， 它是在传统荧光显微镜成像 的基础上采用激光作为光源， 通过使用激光扫描装置和共轭聚焦装置， 利用计算机对所观 察的对象进行数字图像处理的现代化光学显微镜。 它能以极高的分辨率采集细胞或组织内 部的荧光标记图像、 观察细胞或组织内部的微细结构和形态学变化、 在亚细胞水平观察胞 内重要离子浓度或pH的变化、 结合电生理技术观察和记录细胞的生理活动。 使用激光扫描 共聚焦显微镜， 还可以对观察样品进行断层扫描成像、 重构和分析细胞的三维空间结构。 [0003]根据结构的不同， 激光共聚焦显微镜又可分为正置激光共聚焦显微镜及倒置激光 共聚焦显微镜， 其中倒置的激光共聚焦显微镜在医学研究领域使用范围更为广范， 可进行 固定的组织或细胞内亚细胞结构的观察或者养在培养皿底的活细胞的观察； 可满足10X、 20X、 40X、 60X、 100X不同倍数的物镜或者油镜下观 察的需求。 而正置的激光共聚焦显微镜具 有水镜， 可在养有细胞的材料面正置的情况下， 镜头伸入培养基内进 行活细胞观察， 但是水 镜的观察倍数仅局限于40X及60X倍。 由于倒置激光共聚焦显微镜和正置激光共聚焦显微镜 价格昂贵， 每台的售价约400万元。 因此， 由于经费限制， 在医学院的研究设施配备中， 两种 激光共聚焦显微镜都配置的概率非常小。 而由于倒置激光共聚焦显微镜的用途较为广泛， 倒置激光共聚焦显微镜的配备则更常见， 正置 激光共聚焦显微镜配备相对较少。 [0004]然而， 现有的在倒置激光共聚焦下进行材料表面活细胞观察的技术是直接将种有 细胞的材料直接倒扣在激光共聚焦小皿里， 这样会对细胞产生一个压力， 其可能会对实验 结果造成影响。 进一步地， 如果还需在观察的过程中对细胞进行加药刺激， 则会面临 “由于 细胞与皿底之间的间隙太小， 药物无法进入此间隙， 最终导致药物无法作用于细胞 ”的窘 境。 当然， 如果采用正置的激光共聚焦显微镜， 可在一定程度上缓解这一境况， 但由于激光 共聚焦显微镜价格昂贵， 两种激光共聚焦显微镜都配置的概率较小。 基于这种现状， 如何扩 展倒置激光共聚焦显微镜的适用范围， 利用其进行材料表面活细胞的实时观察并加药刺 激， 变得格外迫切。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一种利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加 药刺激的实验方法， 以避免在观察过程中对活细胞产生压力， 并给对细胞进行加药刺激， 适 时观察药物对细胞的作用， 从而扩展倒置 激光共聚焦显微镜的适用范围， 提高利用率。 [0006]本发明通过以下技 术方案实现： [0007]本发明提供一种利用倒置激光共聚焦显微镜进行活细胞观察以及加药刺激的实说　明　书 1/6 页 3 CN 115521965 A 3