ICS 71.100.70 C2682 Y42 团 体 标 准 T/SHRH 022-2019 ________________________________________________________________________________________ 化妆品保湿功效评价 体外重组 3D表皮模型 测试方法 Moisturizing efficacy test of cosmetics - In vitro reconstructed human skin test method 2019-12-30发布 2020-01-30实施 上海日用化学品行业协会 发布 T/SHRH 全国团体标准信息平台 T/SHRH 022-2019 1 目 次 前言…………………………………………………………………………………………… 2 1．范围………………………………………………………………………………………… 3 2. 规范性引用文件 ………………………………………………………………………… 3 3. 术语和定义 ……………………………………………………………………………… 3 4. 试验原则…………………………………………………………………… …………… 3 5. 试剂及仪器设备 ………………………………………………………………………… 3 6. 试验步骤 ………………………………………………………………………………… 4 7. 结果计算 ………………………………………………………………………………… 5 8. 结果判定 ……………………… ………………………………………………………… 5 附录A 资料性附录 …………………………………………………………………………… 6 附录B 资料性附录 …………………………………………………………………………… 7 全国团体标准信息平台 T/SHRH 022-2019 2 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出规则起草。 本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。 本标准的某些内容可能涉及专利，本 标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准起草单位： 广东博溪生物科技有限公司、 上海家化联合股份有限公司、上海上美化妆品有限 公司、上海创元化妆品有限公司、福建片仔癀化妆品有限公司、东阿阿胶股份有限公司、上海绿瑞生 物科技有限公司、云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、 上海日 用化学品行业协 会。 本标准主要起草人： 李潇、李乐、张艳云 、曹平、陈田 、陈静、廖筝筝、曾四立、吴梅芳 、陈贞明、 谢阿贵、廖峰、姜春鹏、赵奕竹 、马骁、王飞飞、 李琼、金坚、陈亦华。 全国团体标准信息平台 T/SHRH 022-2019 3 化妆品保湿功效评价 体外重组 3D表皮模型测试方法 1 范围 本标准规定了一种基于体外重组 3D表皮模型的化妆品原料及化妆品成品的保湿功效测试方法。 本标准可作为化妆品 保湿功效测试替代方法之一 ，也可结合其他方法对化妆品 保湿功效进行评价 。 本标准适用于 具有生物学深层保湿作用的化妆品原料及成品的 保湿功效测试，不适用于吸湿剂 、 封闭剂类化妆品 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 化妆品安全技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本 标准。 体外重组 3D表皮模型 in vitro reconstructed human epidermis model 采用人原代表皮角质形成细胞 ，通过组织工程技术在体外重 组的皮肤组织 ，具有与正常皮肤高度 相似的复层化结构、生理 及代谢功能 。 4 试验原则 4.1 本标准使用的体外 重组 3D表皮模型（ EpiKutis®），具有表皮的复层化结构（基底层、棘层、颗 粒层和角质层 ）和屏障功能。角质细胞内含有丰富的天然保湿因子（ NMF），与皮肤保湿功能高度相 关。 4.2 生物学深层保湿是通过一系列的生物化学作用，提升角质细胞内天然保湿因子含量，达到提升皮 肤保湿功能的作用。 吡咯烷酮羧酸 (Pyrrolidone Carboxylic Acid ，PCA)与尿刊酸（ Urocanic acid ，UCA） 是NMF的重要组成成分，通过对 PCA、UCA的含量分析，可以评价皮肤 生物学深层保湿功能。 5 试剂及仪器设备 5.1材料及试剂 5.1.1 体外重组 3D表皮模型（EpiKutis®）。 5.1.2 体外重组 3D表皮模型培养液 （EpiGrowth 培养液）。 5.1.3 蛋白酶 K。 5.1.4 甲酸铵。 5.1.5 甲醇（色谱纯）。 全国团体标准信息平台 T/SHRH 022-2019 4 5.1.6 乙腈（色谱纯）。 5.1.7 吡咯烷酮羧酸标准品（纯度 99%）。 5.1.8 顺式尿刊酸标准品（ Cis-UCA）（纯度 99%）。 5.1.9 反式尿刊酸标准品（ Trans -UCA）（纯度 99%）。 5.1.10 去离子水（一级）。 5.1.11 磷酸盐缓冲液（ PBS）。 5.2 仪器和设备 5.2.1 超净工作台 。 5.2.2 CO 2培养箱：37℃± 1℃， 5±1%CO 2，95%相对湿度 。 5.2.3 高效液相色谱仪 。 5.2.4 低温高速离心机。 5.2.5 氮气吹干仪。 5.2.6 超声波振荡仪。 5.2.7 超纯水仪。 5.2.8 旋涡震荡仪。 5.2.9 分析天平 (精度 0.1mg)。 6 试验步骤 6.1体外重组 3D表皮模型的准备 该步骤在超净工作台中进行。每轮 测试中，空白对照组和各待测 物组均需要 1块6孔板， 3个体 外重组 3D表皮模型。标记 6孔板，在每个 6孔板的第一排孔中各加入 0.9mL EpiGrowth 培养液。将 模型转移至 6孔板中，置于 CO 2培养箱中培养（ 37±1℃、 5±1% CO 2、95%相对湿度）。 6.2给药 待测物的给药方式为 模型表面给药，给药量为 25µ L；空白对照组不进行给药 处理。模型给药结束 后，将 6孔板转移 至CO 2培养箱中 ，孵育培养 24h（37± 1℃、5± 1% CO 2、95%相对湿度）。 6.3清洗 模型孵育培养结束后 ，开始清洗程序。用无菌 PBS溶液重复清洗 模型表面 15次，去除 残留的待 测物。 6.4 角质层 NMF提取 将体外重组 3D表皮模型用刀片沿边缘环切后，转移至 1.5mL 离心管中，并在每管中加入 500μL 蛋白酶 K工作液（浓度 0.2mg/mL ），置于恒温培养 箱，50℃酶解 1h。用镊子夹取角质层，置于新的 1.5mL 离心管中，并在每管中加入 250μL甲醇，超声波震荡仪震荡 30min，频率 28KHz。结束后，将 离心管放入低温高速离心机 ，4℃ 14000rpm离心 10min，吸取上清液，转移到新的 离心管中，氮气吹 干仪吹干 ， 加入 250μL去离子水 ，超声波震荡30min。 超声结束后， 将离心管放入低温高速离心机 ，4℃ 12000rpm离心 10min，吸取194μL上清液到 内衬管中，加入 5μL 1M甲酸铵母液及 2.5μL乙腈震荡混 匀，待上机。 6.5 测定条件 6.5.1吡咯烷酮羧酸（ PCA）高效液相色谱测 定条件如下： a) 色谱柱： C18柱， 5μm，4.6*250mm 。 全国团体标准信息平台 T/SHRH 022-2019 5 b）流动相： 990mL甲酸铵溶液（ 20mmol/L ）加入 10mL乙腈，搅拌均匀， 0.45μm混合过滤膜过 滤，超声 15min。 c）柱温： 30℃。 d）流动相流速： 0.4mL/min 。 e）进样量： 40μL。 f）检测波长 ：210nm。 g）出峰时间：7.1min。 6.5.2尿刊酸（ UCA）高效液相色谱测定条件如下： a) 色谱柱： C18柱， 5μm，4.6*250mm 。 b）流动相： 990mL甲酸铵溶液（ 20mmol/L ）加入 10mL乙腈，搅拌均匀， 0.45μm混合过滤膜过 滤，超声 15min。 c）柱温： 30℃。 d）流动相流速： 0.4mL/min 。 e）进样量： 40μ